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Création de modèles de souris transgéniques en utilisant la technologie CRISPR-Cas9

La plateforme apporte aux chercheurs le support et l’aide nécessaire pour la conception et la création de modèles de souris transgéniques knock-out ou knock-in en utilisant un ADN template (ADN simple brin ou plasmide). La plateforme discute le projet avec les chercheurs utilisateurs et propose la stratégie expérimentale requise. Le service comprend :

•           Le design de l’ADN template
•      Le design de l’ARN guide
•           La  micro-injection d’un complexe ribonucléo-protéique (ARN guide et nucléase Cas9) et de l’ADN template dans le pronucléus d’ovocytes fécondés
•       Le transfert des ovocytes injectés dans l’oviducte de femelles CD1 pseudo-gestantes
• La commande de l’ARN guide et l’ADN template (Ultramer ou Megamer) est à charge des chercheurs utilisateurs

Transgenèse d’addition par injection de pronucléus

La plateforme réalise l’injection de constructions d’ADN dans le pronucléus d’ovocytes fécondés (obtenus par croisement de souris B6D2F1) et la réimplantation des embryons dans l’oviducte de femelles CD1 pseudo-gestantes. La conception et la réalisation des constructions d’ADN sont à charge des chercheurs utilisateurs. La plateforme fournit des conseils quant au plan des constructions d’ADN et dispose d’un certain nombre de vecteurs et de “cassettes” d’utilité générale. Le rendement attendu est de minimum 3 souris transgéniques par projet.

Transgenèse par recombinaison homologue

Les chercheurs utilisateurs prennent en charge la conception et la réalisation de vecteurs pour la recombinaison homologue en cellules ES. La culture, l’électroporation de cellules ES et la sélection des clones recombinants sont réalisés par les chercheurs utilisateurs, éventuellement avec l’aide de la plateforme. La plateforme de transgenèse peut fournir les cellules ES, ainsi qu’une série de vecteurs et “cassettes” d’utilité générale. La plateforme assure l’injection de cellules ES recombinants en blastocysts (souche B6). Le rendement attendu est de minimum 3 souris chimériques par projet.

Cryopréservation et re-vitalisation de lignées

 Cryopréservation

La cryopréservation des lignées se fait par congélation de sperme.  3 mâles fertiles (âgés de 3 à 4 mois) sont recommandés. Les cryotubes de sperme congelés sont stockés dans l’azote liquide à la cryothèque de l’Institut de Duve.

Re-vitalisation

 La régénération de lignées transgéniques se fait à partir de sperme ou d’embryons congelés.

• La régénération à partir de sperme congelé : les pailles ou cryotubes de sperme sont décongelés et la re-vitalisation de la lignée se fait par fécondation in vitro. Les ovocytes fécondés sont sélectionnés et transférés dans l’oviducte de femelles CD1 pseudo-gestantes ;
• La régénération à partir d’embryons congelés : les pailles ou cryotubes d’embryons sont décongelés et 40 à 50 embryons sont transférés dans l’oviducte de femelles CD1 pseudo-gestantes.